Desenvolvimento e avaliação de uma proteína quimérica recombinante para o diagnóstico e prognóstico das leishmanioses tegumentar e visceral / Development and evaluation of a recombinant chimeric protein for the diagnosis and prognosis of tegumentary and visceral leishmaniasis

As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas com alta endemicidade e que afetam milhares de pessoas no mundo. Sua infecção é causada por parasitos protozoários do gênero Leishmania. A diversidade biológica entre as espécies é quem permite determinar as manifestações clínicas, sendo elas na forma de leishmaniose visceral (LV) ou leishmaniose tegumentar (LT). Dentre estas manifestações, a LV é considerada a mais grave, devido sua alta letalidade e grande emergência em indivíduos com a infecção provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Atualmente, as medidas de controle e prevenção adotadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS), baseiam-se em uma combinação de estratégias de intervenção contra a infecção, uma vez que o diagnóstico eficaz e precoce é indispensável para que se possa intervir com o tratamento adequado, diminuindo índices de mortalidade e a evolução de complicações clínicas. Entretanto, os testes sorológicos utilizados apresentam sensibilidade e especificidade prejudicadas em pacientes com leishmanioses e/ou coinfectados LV/HIV, devido a baixos ní-veis de anticorpos antileishmanial ou pela presença de doenças que causem reação cruzada, levando a resultados falso-positivos. A sensibilidade torna-se também variável em pacientes tratados, uma vez que a sorologia pode manter-se positiva por meses ou anos após o fim do tratamento e cura da doença. Buscando resolver tal problemática, a identificação de novos antígenos, por meio de análises de bioinformática associadas à imunoproteômica, tem permitido a detecção de novas proteínas com potencial aplicação diagnóstica. Em estudos anteriores, as proteínas hipotéticas LiHyT, LiHyD, LiHyV e LiHyP foram encontradas em espécies de Leishmania spp, e avaliadas em suas versões recombinantes por meio de ensaios de ELISA, obtendo resultados satisfatórios para a detecção da LV humana e canina. Com base nessas informações, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma proteína quimera recombinante base-ada na predição de epítopos lineares específicos de células B das quatro proteínas antigênicas de L. infantum citadas e avaliar o potencial diagnóstico, assim como dos peptídeos individuais que a constituíram, frente à leishmaniose humana, bem como com a coinfecção com HIV, além de testar os antígenos como marcadores prognóstico após o tratamento da LV e LT. As sequências de aminoácidos das proteínas foram avaliadas e oito epítopos de células B foram preditos e utilizados na construção de uma nova proteína quimérica. A proteína foi expressa, purificada e avaliada como antígeno recombinante em ELISA para o diagnóstico de LV, LT, coinfecção LV/HIV e prognóstico em amostras de pacientes tratados de LV e LT. Os epítopos de células B usados na construção da quimera foram sintetizados e também testados em ELISA frente às mesmas amostras, assim como um extrato antigênico solúvel de Leishmania braziliensis (SLA). Os resultados mostraram que a proteína quimera apresentou sensibilidade e especificidade de 100% para diagnosticar a LV, LT e LV/HIV, enquanto os peptídeos sintéticos apresentaram sensibilidade variando entre eles de 9,1% a 90,9% para amostras de LT e 76,8% a 99,2% para amostras de LV e LV/HIV, já os valores de especificidade atingiram 98,3% a 99,1% para LT e 67,1% a 95,7% para LV e LV/HIV. O SLA apresentou sensibilidade e especificidade de 18,2% e 98,3% para LT, e 56,8% a 69,5% para amostras de LV e LV/HIV, respectivamente. Uma avaliação prognóstica preliminar mostrou ainda que os anticorpos anti-quimera diminuíram em níveis significativos, quando comparada a reatividade sorológica antes e seis meses após o tratamento, sugerindo um possível papel prognóstico da quimera para as leishmanioses. O presente estudo, mostrou-se eficaz na construção e avaliação de novos candidatos, que demonstram ter um bom desempenho na detecção diagnóstica e prognóstica para as leishmanioses e dos casos de coinfecção LV/HIV.

Leishmaniasis are neglected tropical diseases with high endemicity that affect thousands of people in the world. Infection is caused by protozoan parasites of the genus Leishmania. The biological diversity between species is what allows determining the clinical manifestations, either in the form of visceral leishmaniasis (VL) or tegumentary leishmaniasis (TL). Among these clinical manifestations, VL is considered the most serious, due to its high lethality and great emergence in individuals with infection caused by the human immunodeficiency virus (HIV). Currently, the control and prevention measures adopted by the World Health Organiza-tion (WHO) are based on a combination of intervention strategies against the infection, since an effective and early diagnosis is essential to intervene with the appropriate treatment, decrea-sing mortality rates and evolution of clinical complications. However, the serological tests used show impaired sensitivity and specificity in patients with leishmaniasis and/or coinfected with VL/HIV, due to low levels of anti-leishmanial antibodies or the presence of diseases that cause cross-reaction, leading to false-positive results. The sensitivity also becomes variable in treated patients, since the serology can remain positive for months or years after the end of the trea-tment and cure of the disease. Seeking to solve this problem, the identification of new antigens, through bioinformatic analysis associated with immunoproteomic, has allowed the detection of new proteins with potential diagnostic application. In previous studies, the hypothetical proteins LiHyT, LiHyD, LiHyV and LiHyP were found in species of Leishmania spp, and evaluated in their recombinant versions through ELISA assays, and satisfactory results were obtained for the detection of human and canine VL. Based on this information, the present work aimed to develop a recombinant chimera protein through on the prediction of specific linear epitopes of B cells derived from these four antigenic proteins of L. infantum and to evaluate its diagnostic potential, as well as the individual peptides that constitute it, against human leishmaniasis, as well as co-infection with HIV, in addition to testing them as possible prognostic markers of patients after VL and TL treatment. The amino acid sequences of the proteins were evaluated and eight B cell epitopes were predicted and used in the construction of a new chimeric protein. The protein was expressed, purified and evaluated as a recombinant antigen in ELISA for the diagnosis of VL, TL, VL/HIV co-infection and prognosis in samples from patients treated for VL and TL. The B cell epitopes used in the construction of the chimera were synthesized and also tested in ELISA against the same samples, as well as a soluble Leishmania braziliensis antigenic extract (SLA). The results showed that the chimera protein apresented sensitivity and specificity of 100% for diagnosing VL, TL and VL/HIV, while the synthetic peptides showed sensitivity ranging from 9.1% to 90.9% for TL samples and 76.8 % to 99.2% for VL and VL/HIV samples, while the specificity values reached from 98.3% to 99.1% for TL and 67.1% to 95.7% for VL and VL/HIV. The SLA showed sensitivity and specificity of 18.2% and 98.3% for TL, and 56.8% to 69.5% for VL and VL/HIV samples, respectively. A preliminary prog-nostic evaluation also showed that anti-chimera antibodies significantly decreased when com-pared to serological reactivity before and six months after treatment, suggesting a possible prognostic role of the antigen for leishmaniasis. The present study proved to be effective in the construction and evaluation of new candidates, who demonstrate good performance in diagnos-tic and prognostic detection for leishmaniasis and VL/HIV co-infection.

Metapneumovirus humano: epidemiología y posibles tratamientos profilácticos / Human Metapneumovirus: Epidemiology and Possible Prophylactic Treatments

Resumen En el 2001, se identificó en Holanda al metapneumovirus humano (hMPV) como un "nuevo" agente etiológico causante de infecciones respiratorias agudas en infantes menores de 5 años; sin embargo, también se ha aislado en personas de la tercera edad e inmunocomprometidos. Este virus se considera como el segundo agente etiológico en enfermedades agudas del tracto respiratorio. En la actualidad, el costo estimado de las infecciones respiratorias agudas (IRA) en nuestro país es de 9,000 dólares estadounidenses por paciente hospitalizado. El hMPV es un miembro del género Metapneumovirus, familia Pneumoviridae, que pertenece al orden de los Mononegavirales, correspondiente a virus de ácido ribonucleico (RNA) monocatenario negativo, que consta de 8 genes en el orden 3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5', y que codifica para 9 proteínas. De estas proteínas, la glicoproteína de fusión F está altamente conservada en el género Metapneumovirus y es el mayor determinante antigénico, y al no existir aún vacuna aprobada para este virus, se ha utilizado como un epítopo candidato para el diseño de una vacuna que confiera inmunidad al hospedero o como un blanco terapéutico en la creación de péptidos antivirales que inhiban la fusión del virus a su célula blanco y se evite la infección en sujetos de alto riesgo de contagio, ya que en la actualidad no se ha aprobado por la COFEPRIS ningún tratamiento profiláctico contra hMPV.

Abstract In 2001 in the Netherlands, Human metapneumovirus (hMPV) was identified as a "new" etiologic agent causing acute respiratory infections in children younger than 5 years old; however, it has also been isolated in the elderly and immunocompromised people. This virus is considered the second etiological agent in acute diseases of the respiratory tract. Currently, the estimated cost of IRAs in our country is of 9,000 USD per inpatient. hMPV is a member of the genus Metapneumovirus, family Pneumoviridae, and it belongs to the order Mononegavirales that is part of the negative single-stranded ribonucleic acid (RNA) virus, consisting of eight genes ordered: 3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5 ', and which encodes for 9 proteins. Of these proteins, the F fusion glycoprotein is highly conserved in the genus Metapneumovirus, and is the major antigenic determinant, and because an approved vaccine doesn't exist, it has been used as a candidate epitope for the design of a vaccine that confers host immunity or as a therapeutic target in the creation of antiviral peptides that inhibit the fusion of the virus to its target cell and to avoid infection in subjects at high risk of contagion since there is currently none accepted by COFEPRIS as a prophylactic treatment against hMPV.

Las células dendríticas plasmacitoides evocan la respuesta efectora de los linfocitos T citotóxicos específicos para Salmonella / The plasmacytoid dendritic cells evoke Salmonella-specific CTL effector response

Resumen Introducción. La función inmunológica de las células dendríticas plasmacitoides durante las infecciones bacterianas, como la de Salmonella spp., es poco conocida. En ese contexto, se analizó su función efectora para presentar antígenos de Salmonella Typhimurium ante linfocitos T citotóxicos. Objetivo. Analizar la respuesta de los linfocitos T citotóxicos específicos para Salmonella evocada por las células dendríticas plasmacitoides. Materiales y métodos. Se usaron células dendríticas plasmacitoides marcadas con éster de succinimidil-carboxifluoresceína, pulsadas con el epítopo de Salmonella OmpC73 Kb- restringido o infectadas con S. Typhimurium como blanco en ensayos de citotoxicidad. Resultados. La lisis específica tuvo significación estadística usando células dendríticas plasmacitoides positivas pulsadas con OmpC73 en todas las relaciones de células efectoras y blanco (E:B) (p≤0,05); en cuanto a las células dendríticas plasmacitoides positivas para S. Typhimurium, solo se observó significación estadística en la relación de 1:100 (p≤0,05) usando las células efectoras OmpC73. Conclusión. Las células dendríticas plasmacitoides pueden evocar la respuesta de los linfocitos T citotóxicos durante la infección con S. Typhimurium.

Abstract Introduction: The immunological role of plasmacytoid dendritic cells (pDC) in bacterial infections such as Salmonella has been poorly documented. Therefore, we analyzed the effector function of these cells by presenting cytotoxic T lymphocytes (CTL) with Salmonella Typhimurium antigens. Objective: To analyze the Salmonella-specific CTL response evoked by pDCs. Materials and methods: We used plasmacytoid dendritic cells stained with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and pulsed with OmpC73, Salmonella Kb- restricted epitopes or S. Typhimurium as targets for cytotoxicity assays. Results: Specific lysis was shown to be statistically significant in pDC + OmpC73 for all effector:target ratios (p≤0.05). For pDC + S. Typhimurium, statistical significance was only observed at a 1:100 ratio (p≤0.05) using OmpC73. Conclusion: Plasmacytoid dendritic cells evoke CTL response during S. Typhimurium infection.

Determinación in silico de las propiedades inmunogénicas de la glicoproteína E de Zika virus / In silico determination of immunogenic properties of glycoprotein E from Zika Virus

Introducción: La infección por Zika virus (ZIKV) ha sido asociada a múltiples complicaciones y nuevas formas de transmisión. La descripción del genoma y la estructura cristalizada permiten desarrollar análisis moleculares, incluyendo las propiedades inmunológicas. Objetivos: En este trabajo, se analiza a la glicoproteína E de ZIKV, con el fin de determinar su utilidad en la creación de una vacuna proteica recombinante. Métodos: Se analizó la glicoproteína E, por medio del software DNASTAR, en base a su antigenicidad de epítopos de células B y MHC-II, estructura secundaria, hidrofilizada, flexibilidad y accesibilidad a solvente en el virión maduro e hidratado. Resultados: Se identificaron 14 sitios antigénicos para células B, de los cuales, 7 comparten su antigenicidad para MHC-II. Al tomar en cuenta los demás parámetros analizados, los sitios se reducen a 3, con longitudes de 13, 9 y 5 aminoácidos. Conclusiones: La glicoproteína E de ZIKV podría desencadenar una respuesta inmune T-dependiente, por tanto, ser útil para la creación de una vacuna proteica recombinante.

Introduction: Zika virus (ZIKV) infection have been associated with multiple complications and new ways of transmission. The description of the genome and the crystalized structure allow the performance of molecular analysis, including immunological properties. Objectives: In this paper, we analyze glycoprotein E from ZIKV to determine its utility in the development of a recombinant protein vaccine. Methods: The protein was analyzed with the software DNASTAR, through the following properties: B cells and MHC-II antigenicity, secondary structure, hydrophilicity, flexibility and solvent-accessibility in the mature and hydrated virion. Results: We identified 14 antigenic sites with B-cells antigenicity, 7 of which shared the antigenicity for MHC-II. Considering other parameters analyzed, sites were reduced to 3, with length of 13, 9 and 5 amino acids. Conclusions: Glycoprotein E, from ZIKV, could trigger a T-dependent immune response, and therefore, may be useful in the creation of a recombinant protein vaccine.

Troponin I (cTnI) fragments immunoreactivity and the development of high-sensitivity diagnostic assays for the associated diagnosis of acute myocardial infarction / Imunorreatividade de fragmentos da troponina I (cTnI) e desenvolvimento de ensaios de alta sensibilidade para o diagnóstico associado do infarto agudo do miocárdio

ABSTRACT Among the cardiovascular diseases (CVD), acute myocardial infarction (AMI) is currently considered the most common cause of death and disability worldwide. Several laboratory tests have been developed for the detection of cardiac injury, including troponins that are considered the gold standard marker (surrogate biomarker) of myocardial injury. The high specificity of troponin for cardiomyocyte necrosis is related to a single unique peptide sequence present in troponin at the cardiac muscle. As a result, studies are currently focused on the development of troponin (hs-cTnI) determination tests with high diagnostic sensitivity value. These diagnostic tests aim to detect increasingly lower serum concentrations of cTnI biomarkers, from the detection of peptide fragments that are released after structural biochemical changes. This article discusses the differences between troponin fragments immunoreactivity to the development of cTnI determination tests, such as the high-sensitivity tests, which arise with the proposal of guaranteeing greater efficiency in the AMI associated diagnosis.

RESUMO Entre as doenças cardiovasculares (DCV), o infarto agudo do miocárdio (IAM) atualmente é considerado a causa mais comum de morte e incapacidade em todo o mundo. Vários testes laboratoriais vêm sendo desenvolvidos para a detecção de lesões cardíacas, entre eles, as troponinas, consideradas marcador (biomarcador sugestivo) padrão-ouro de lesão miocárdica. A alta especificidade da troponina para a necrose dos cardiomiócitos está relacionada com a sequência peptídica única presente na troponina do músculo cardíaco. Em função disso, estudos estão voltados para o desenvolvimento de conjuntos diagnósticos de alta sensibilidade para a determinação das troponinas I (hs-cTnI). Esses conjuntos diagnósticos surgem com o objetivo de detectar concentrações séricas cada vez menores desses biomarcadores a partir da detecção de fragmentos peptídicos que são liberados após modificações bioquímicas estruturais. O presente artigo discorre sobre as diferenças de imunorreatividade dos fragmentos de troponina no desenvolvimento de nossos testes para a determinação da cTnI, a exemplo dos testes de alta sensibilidade, que surgem com a proposta de garantir maior eficiência no diagnóstico associado do IAM.

Reconhecimento molecular na doença de chagas do ponto de vista do parasita e do hospedeiro / Molecular recognition in Chagas disease from the point of view of the parasite and the host

A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi, afeta milhões de pessoas, a maioria delas vivendo na América latina. Apesar dos avanços da medicina e da biotecnologia, ainda existem poucas opções de tratamento para indivíduos com a doença. Assim, é importante compreendermos os detalhes moleculares da infecção parasitária, para que novas alternativas terapêuticas e de diagnóstico possam ser desenvolvidas para esses pacientes. Neste trabalho estudamos esta doença em duas frentes, uma do ponto de vista do parasita, e a outra, da resposta do hospedeiro. Utilizando bioinformática, identifcamos um peptídeo conservado (denominado TS9) presente nas proteínas de superfície gp85/transsialidases do parasita. Este peptídeo é capaz de promover adesão celular e, na sua forma sintética, inibe a entrada do T. cruzi na célula hospedeira. Análise da estrutura proteica revelou que o peptídeo TS9 encontra-se num domínio do tipo laminina-G, lado-a-lado com o peptídeo FLY, outro peptídeo conservado desta grande família, previamente descrito pelo nosso grupo. Juntos, eles formam um sítio de adesão a citoqueratinas e proteínas de flamento intermediário. Na segunda parte, investigamos os antígenos e epítopos reconhecidos pelas imunoglobulinas de pacientes portadores da doença nas suas diferentes formas clínicas: assintomática e cardiomiopatias, leve ou grave. Criamos uma biblioteca de phage display contendo, virtualmente, todos os fragmentos proteicos existentes no T. cruzi, que foi varrida contra imunoglobulinas para a construção de um mapa da resposta humoral dos pacientes com a doença de Chagas. Nossos resultados mostram que a resposta dos pacientes é complexa, e mais de dois mil epítopos foram mapeados. Muitos deles, como os antígenos B13, SAPA e FRA já foram previamente descritos, validando nosso método. Porém, um grande número de novos epítopos, inclusive contra proteína descritas como hipotéticas ou sem função conhecida, também foram encontrados. Seus papéis na infecção e resposta imune da doença merecem, portanto, atenção. Em resumo, as abordagens e técnicas utilizadas nesta tese são inovadoras, e permitiram a identificação de peptídeos e moléculas que poderão ser úteis para o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos e terapêuticos para a doença de Chagas

Chagas disease, caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, afects millions of people, most of them living in Latin America. Despite advances in medicine and biotechnology, there are still few treatment options for individuals with the disease. Thus, it is important to understand the molecular details of the parasitic infection, so that new therapeutic and diagnostic alternatives can be developed for these patients. In this work, we study this disease in two fronts, one from the point of view of the parasite, and the other, of the response of the host. Using bioinformatics, we identifed a conserved peptide (called TS9) present in the surface proteins gp85 / trans-sialidases of the parasite. This peptide is capable of promoting cell adhesion and, in its synthetic form, inhibits the entry of T. cruzi into the host cell. Analysis of the protein structure revealed that the TS9 peptide is in a laminin-G-like domain, side-by-side with the peptide FLY, another conserved peptide of this large family, previously described by our group. Together, they form an adhesion site to cytokeratins and intermediate flament proteins. In the second part, we investigated the antigens and epitopes recognized by the immunoglobulins of patients with the disease in their diferent clinical forms: asymptomatic and cardiomyopathies, mild or severe. We created a phage display library containing virtually all existing protein fragments in T. cruzi. This library was screened against immunoglobulins for the construction of a humoral response map of patients with Chagas disease. Our results show that the response of the patients is complex, and more than 2,000 epitopes have been mapped. Many of them, such as the B13, SAPA and FRA antigens have been previously described, validating our method. However, a large number of new epitopes, including many against proteins described as hypothetical or with no known function, were also found. Their roles in infection and immune response of the disease deserve, therefore, attention. In summary, the approaches and techniques used in this thesis are innovative and have allowed the identifcation of new peptides and molecules that may be useful for the development of new diagnostic and therapeutic methods for Chagas disease

Fenômeno de epitope spreading: caracterização clínico imunológica em pacientes portadores de dermatoses bolhosas autoimunes / Epitope spreading" phenomena: clínical and immunopathological characterization in patients with bullous dermatosis

As dermatoses bolhosas autoimunes são um grupo heterogêneo de afecções da pele e/ou mucosas associadas à produção de autoanticorpos dirigidos às moléculas de adesão epitelial. Podem ser classificadas em dermatoses bolhosas intraepidérmicas (pênfigos) ou subepidérmicas (penfigóides, epidermólise bolhosa adquirida). Nos últimos anos, a transição entre dermatoses bolhosas autoimunes ou coexistência de autoanticorpos de diferentes dermatoses têm sido relatadas em alguns pacientes e atribuída ao fenômeno de epitope spreading (ES): a diversificação de epítopos reconhecidos pelo sistema imune evocaria uma reação secundária a antígenos distintos e não relacionados aos da doença primária. Neste trabalho avaliamos a ocorrência de fenômenos de ES em pacientes portadores de pênfigo. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Inicialmente, foi realizada análise de dados clínicos e laboratoriais (exame histopatológico, de imunofluorescência direta-IFD, indireta IFI e ELISA) de 351 pacientes portadores de pênfigos acompanhados no Ambulatório de dermatoses bolhosas autoimunes do Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de dezembro de 2002 a dezembro de 2012. Foram selecionados pacientes com quadro sugestivo de conversão à dermatose bolhosa distinta da doença primária. RESULTADOS: Nove pacientes apresentaram sinais sugestivos de fenômeno de ES e foram incluídos no estudo: 8 com a conversão de Pênfigo vulgar (PV) a foliáceo (PF) 2,3% (grupo1) e um de PF a Epidermólise bolhosa adquirida (EBA) 0,3% (grupo 2). No grupo 1 o intervalo mediano para a conversão foi de 3,5 anos. Cinco pacientes apresentaram modificação histopatológica de clivagem intraepidérmica na camada suprabasal para clivagem na camada subcórnea durante a suspeita de ES; 2 apresentaram clivagem na camada epidérmica média durante a transição e um manteve clivagem suprabasal, apesar de quadro clínico sugestivo de PF. Todos os pacientes apresentavam...

Autoimmune bullous skin diseases represent a heterogeneous group of disorders of skin and mucosa associated with autoantibodies against distinct adhesion molecules. They can be classified, based on the level of loss of adhesion in intraepidermal and sub epidermal dermatosis. The shift from an autoimmune blistering disease to another has been recently described and attributed to the "epitope spreading" (ES) phenomena. It occurs when a primary inflammatory/autoimmune process releases "hidden" epitopes which are recognized by the lymphocytes and evoke a secondary reaction to antigens distinct from, and non-cross-reactive, with the disease causing-epitope. This study attempted to characterize the occurrence of ES in pemphigus patients. METHODS: We analyzed data from 351 pemphigus patients treated ambulatorially at the Department of Dermatology, Faculty of Medicine, University of São Paulo, from December 2002 to December 2012. A careful search for clinical and laboratorial (histopathology, direct-DIF and indirect-IIF immunofluorescence, ELISA) changes suggestive of shift to a secondary bullous disease was performed. RESULTS: Nine out of 351 patients presented clínical shift and were included in the study: eight from pemphigus vulgaris (PV) to foliaceus (PF) 2.3% (group 1) and one from PF to epidermolysis bullosa acquisita (EBA) 0.3% (group 2). In group 1, median interval of disease shift was 3.5 years. Of 8 patients with clinical PF, five showed change of histopathology pattern from suprabasilar cleavage to subcorneal acantholysis, two had cleavage within the middle epidermal layer, and one sustained the suprabasilar acantholysis. One shifted back to PV after clinical and histopatological changes of PF. All patients showed intercellular IgG and/or C3 deposits during PV and PF diagnosis by DIF. IIF titers varied from 1:160 to 1:5120. ELISA index for Dsg1 varied from 22 to 319; and for Dsg3 from 0.4 to 224 (positive if > 20)....

Alergias alimentarias y la influenciade los métodos de procesado / Food allergies and the influence of processing methods / Alergias alimentares e a influênciados métodos de processamento

La incidencia de alergias alimentarias en los países desarrollados se estima que puede ser de un 3-4% en adultos y de un 6-8% en niños y sigue aumentando rápidamente. Los alérgenos alimentarios son principalmente proteínas que causan una respuesta inmune mediada por IgE, pero el mecanismo de esta respuesta todavía no es claro. La alergia al huevo es una causa frecuente de hipersensibilidad durante la niñez. La resistencia a la digestión es un criterio usado en los ensayos de alergenicidad de una proteína. En adición, es necesario tener en cuenta el efecto sobre las proteínas de los tratamientos comúnmente aplicados a los alimentos. Estos tratamientos pueden modificar la estructura de la proteína, cambiando su digestibilidad y alterando su alergenicidad.

The incidence of food allergy in developed countries is estimated to be 3-4% in adults and up to 6-8% in children, and it seems to be rising rapidly. Food allergens are mainly proteins that cause an IgE-mediated immune response, but the mechanism for this response still remains unclear. Egg allergy is a common cause of hypersensitivity in children. The resistance to digestion is one of the criteria used to assess the allergenicity of a protein. In addition, it is necessary to take into account the effect on proteins of the treatments that are commonly applied to foods. These treatments can modify the protein structure, changing the digestibility of the protein and thus altering its allergenicity.

Estima-se que a incidência de alergias alimentares nospaíses desenvolvidos pode ser 3-4% em adultos e 6-8%em crianças e continua aumentando rapidamente. Osalérgenos alimentares são principalmente as proteínasque causam uma resposta imune mediado por IgE, maso mecanismo desta resposta ainda não é claro. A alergia ao ovo é uma causa frequente da hipersensibilidade durante a infância. A resistência à digestão é um critério usado nos ensaios de alergenicidade de uma proteína. Além disso, é preciso ter em conta o efeito sobre as proteínas dos tratamentos normalmente aplicados aos alimentos. Estes tratamentos podem modificar a estrutura da proteína, alterando a sua digestibilidade e modificando a sua alergenicidade.

Mapeo computacional de epítopos de células B presentes en el virus del dengue / B-cell epitopes mapping of dengue virus

Dengue es una infección viral de importancia en salud pública. El desarrollo de una vacuna va a depender del conocimiento de aquello epítopos que neutralicen la infección y por ello, se generaron e identificaron computacionalmente aquellos epítopos lineales consenso de células B presentes en el virus del dengue, a partir de los datos depositados en la base de datos Immune Epitope Database (IEDB). Posteriormente, se agruparon en bloques de ocho aminoácidos por cada serotipo mediante el programa Nomad, y cada uno de ellos fue reevaluado con el programa BepiPred para determinar su antigenicidad. Se lograron postular 172 de los 1.239 obtenidos en la IEDB.

Dengue virus has emerged as a major public health problem. An epitope-based approach to the development of vaccines, and for this reason, based on Immune Epitope Database database (IEDB), linear consensus B-cell epitopes were computationally generated and identified from dengue virus. Then, amino acids were grouped into blocks of eight amino acids per serotype through Nomad program. Each block was evaluated using BepiPred for determining antigenic prediction. 172 out of 1239 were obtained from IEDB.

Antigen mimicry followed by epitope spreading: A pathogenetic trigger for the clinical morphology of lichen planus and its transition to Graham Lassueur Piccardi Little Syndrome and keratosis lichenoides chronica - Medical hypotheses or reality? / Mimetismo antigênico seguido de espalhamento de epítopos: agente desencadeador patogênico da morfologia clínica do líquen plano e de sua transição para a Síndrome de Graham-Little-Piccardi-Lassueur e para a ceratose líquenóide crônica - Hipótese médica ou realidade?

Literature data analysis, providing an exact explanation of the lichen planus pathogenesis, as well as its transition into other rare forms such as Keratosis lichenoides chronica or Graham Lassueur Piccardi Little Syndrome are scant, or totally missing. The chronological course of the disease, known in the literature as lichen planus, varies. Some patients develop Lichen planus or lichen nitidus and there is no logical explanation why. It is also not clear why single patients initially develop ulcerative lesions in the area of the mucosa and only in a few of them these lesions affect the skin. Antigen Mimicry and Epitope Spreading could be the possible pathogenic inductor in cases of lichenoid dermatoses, as well as the cause for their transition into ulcerative, exanthematous or other rare forms. The Epitope Spreading is probably not the leading pathogenetic factor in lichen planus but a phenomenon which occurs later. This manuscript analyzes some basic pathogenic aspects and presents some possible medical hypotheses regarding the heterogenic clinical picture and pathogenesis of lichen planus and lichenoid like pathologies of the skin which, in the near future should be analyzed in details in order to clarify several dilemmas the clinical dermatologist has to face.

Análises das informações disponíveis na literatura que forneçam uma explicação precisa sobre a patogênese do Líquen Plano, assim como sobre sua transição para outras formas raras da doença, como Ceratose Liquenóide Crônica ou Síndrome de Graham-Little-Piccardi- Lassueur , são raras ou inexistentes. O curso cronológico da doença, conhecida na literatura como Líquen Plano, varia. Alguns pacientes desenvolvem Líquen Plano ou Líquen Nítido e não ha uma explicação lógica do por quê. Também não está claro por que alguns pacientes inicialmente desenvolvem lesões ulcerativas na área da mucosa e em apenas alguns deles essas lesões afetam a pele. Mimetismo Antigênico ou Espalhamento de Epítopos poderiam ser fatores patogênicos indutores em casos de Dermatoses Liquenóides, e também fatores responsáveis pela transição para a forma ulcerativa, exantematosa ou outras formas raras da doença. Espalhamento de Epítopos provavelmente não é o principal fator patogênico envolvido no Líquen Plano, mas um fenômeno de ocorrência posterior.Esse manuscrito analisa alguns aspectos patogênicos básicos e apresenta algumas hipóteses médicas sobre o quadro clínico heterogênico e a patogênese do Líquen Plano e de patologias da pele do tipo liquenóide. Essas patologias devem, em um futuro próximo, ser analisadas minuciosamente a fim de esclarecer vários dilemas que o dermatologista clínico tem de enfrentar.

Caracterização fenotípica e funcional de linfócitos T de memória de indivíduos infectados pelo HIV reativos a epitopos T CD4+ derivados de sequências do consenso B do HIV-1 / Phenotypic and functional characterization of memory T lymphocytes from HIV infected individuals reactive to CD4-T epitopes derived from sequences of the HIV-1 B consensus

A persistência de células T de memória funcionais é importante para garantir uma imunidade protetora na infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). As células T de memória têm sido subdivididas em memória central (TCM), memória efetora (TEM) e memória efetora altamente diferenciada (TEMRA) com base na expressão de moléculas de superfície como CCR7 e CD45RA, e na capacidade de produzir citocinas e proliferar. Recentemente, identificamos 18 peptídeos derivados de seqüências do consenso B do HIV-1, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR e amplamente reconhecidos por linfócitos T de sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV. Diante disso e considerando a importância das células T de memória na manutenção da resposta imune específica, nosso objetivo foi caracterizar fenotípica e funcionalmente as subpopulações de células T de memória de indivíduos infectados pelo HIV envolvidas no reconhecimento in vitro desses epitopos. Foram incluídos 14 indivíduos controles sadios e 61 pacientes HIV+ com contagem de linfócitos T CD4+ maior que 250 células/mm3. Os pacientes HIV+ foram divididos em seis diferentes grupos clínicos de acordo com o estágio da infecção, carga viral (CV) plasmática e uso de terapia anti-retroviral (ART): não progressores por longo tempo (LTNP), avirêmicos em uso de ART (AV-ART), virêmicos em uso de ART (VI-ART), virêmicos sem uso de ART (VI sem ART), virêmicos recém infectados sem uso de ART (VI-RI) e controladores. Células mononucleares do sangue periférico dos indivíduos do estudo foram estimuladas com o conjunto de peptídeos do HIV-1 e com um conjunto de peptídeos do Citomegalovírus (CMV). A freqüência de células de memória produtoras de IFN- e IL-2 e a proliferação celular antígeno-específica foram detectadas por citometria de fluxo de multiparâmetros. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de ativar subpopulações funcionais de memória TCM, TEM e TEMRA secretoras de IFN- e IL-2 em 100%...

The persistence of functional memory T cell is important to ensure a protective immunity to Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection. Memory T cells have been subdivided into central memory (TCM), effector memory (TEM) and highly differentiated effector memory (TEMRA) based on the expression of surface molecules such as CCR7 and CD45RA, and the ability to produce cytokines and proliferate. Recently, we identified 18 peptides derived from B consensus sequences of HIV-1 that bind to multiple HLA-DR molecules and are widely recognized by peripheral blood T lymphocytes from HIV-infected patients. Given this and considering the importance of memory T cells in the maintenance of specific immune response, our objective was to characterize phenotypic and functionally memory T cell subsets from HIV-infected individuals involved in the recognition of these epitopes in vitro. The study included 14 healthy control subjects and 61 HIV+ patients with CD4+ lymphocytes counts higher than 250 cells/mm³. The HIV+ patients were divided into six different clinical groups according to the stage of infection, plasma viral load (VL) and antiretroviral therapy use (ART): long-term non-progressors (LTNP), aviremic under ART (AV-ART), viremic under ART (VI-ART), viremic without using ART (VI without ART), recently infected viremic without using ART (VI-RI) and controllers. Peripheral blood mononuclear cells from study subjects were stimulated with HIV-1 peptide pool and with a cytomegalovirus (CMV) peptide pool. The frequencies of IFN- and IL-2 producing memory cells and antigenspecific cell proliferation were detected by multiparametric flow cytometry. Our results showed that the HIV-1 set of peptides was able to activate TCM, TEM and TEMRA functional memory subsets that secrete IFN- and IL-2 in 100% of the HIV patients from the different clinical groups. The HIV-1 set of peptides also induced memory T lymphocyte subsets proliferation...

Significado do epitope spreading na patogênese dos pênfigos vulgar e foliáceo / Significance of epitope spreading in the pathogenesis of pemphigus vulgaris and foliaceus

Os pênfigos são dermatoses bolhosas auto-imunes, em que há a produção de auto-anticorpos direcionados contra moléculas de adesão dos epitélios, levando à perda da coesão celular. A produção de auto-anticorpos ocorre quando os pacientes desenvolvem um desequilíbrio da resposta imune (quebra da tolerância imunológica), passando a reconhecer antígenos próprios. A resposta é geralmente direcionada contra um único epítopo alvo; entretanto, como conseqüência da resposta inflamatória do processo primário e do extenso dano tecidual ocasionado, pode haver exposição de componentes protéicos ocultos, levando à produção de diferentes auto-anticorpos. Assim, é possível que surja uma nova doença cutânea auto-imune, em decorrência do fenômeno intra ou intermolecular de epitope spreading. São revistos os principais conceitos desse fenômeno e sua ocorrência nas dermatoses bolhosas auto-imunes, com ênfase nos pênfigos, grupo de dermatoses bolhosas autoimunes mais prevalente no Brasil.

Pemphigus comprises autoimmune blistering skin diseases in which autoantibodies directed against antigens (epithelial adhesion molecules) are found, leading to loss of cell cohesion. The production of autoantibodies occurs due to an immune imbalance (break of immune tolerance) driving to recognition of self- antigens. The response is usually directed against an exclusive target epitope; however, due to the inflammatory response and to the extensive tissue damage, it is possible that the exposure of hidden protein components leads to distinct autoantibody production. Hence, a new autoimmune disease may occur in consequence of an intra- or intermolecular epitope spreading phenomenon. The authors review the main concepts of this phenomenon, and its occurrence in autoimmune blistering diseases, with emphasis on pemphigus, the most prevalent disease of this group in our country.

Estudo do reconhecimento de epitopos das proteínas Gag e Nef do HIV-1 por linfócitos T em indivíduos cronicamente infectados pelo HIV-1 não progressores por longo tempo / Study of the recognition of HIV-1 Gag and Nef epitopes by T lymphocytes in chronically infected HIV-1 long-term non-progressors

Os linfócitos T têm um papel central no controle da infecção pelo HIV-1. As respostas mediadas por esses linfócitos contra epitopos do HIV-1 restritos a moléculas HLA de classe I podem estar associadas à proteção natural em indivíduos LTNP. Relatos sugerem que determinados alelos HLA apresentam-se mais representados entre os LTNP. Para avaliar esses aspectos na coorte francesa ALT, coletamos células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de 24 indivíduos LTNP e verificamos a frequência de respostas específicas para o HIV-1. Para isso, utilizamos pools de peptídeos sobrepostos de Gag e regiões imunodominantes da RT e Nef, e identificamos epitopos do HIV-1 restritos a moléculas HLA de classe I, associados ou não à proteção, através do ensaio de ELISPOT IFN-?. Todos os indivíduos apresentaram respostas específicas aos pools testados, com uma mediana de 5 (2-12). Todas as proteínas do HIV-1 foram reconhecidas, sendo que Gag-p24 e Nef foram as mais frequentemente reconhecidas pelas CMSP dos indivíduos avaliados. A intensidade total de resposta de linfócitos T específicos aos pools de Gag, RT e Nef do HIV-1 em cada indivíduo variou de 160 a 12307 SFC/106 CMSP (mediana: 2025). Observamos o reconhecimento de 22 epitopos já descritos na literatura, contidos nas proteínas Gag-p17, Gag-p24 e Nef do HIV-1, restritos a moléculas HLA de classe I, a maioria descrita como protetoras da progressão para a doença. Quatro novos epitopos ainda não descritos na literatura também foram observados. Concluímos que: respostas específicas mediadas por linfócitos T, eficazes e dirigidas contra um amplo painel de epitopos do HIV-1, estão presentes nos indivíduos LTNP; a presença de moléculas HLA de classe I associadas à proteção favorece o reconhecimento preferencial de epitopos do HIV-1 restritos por elas na maioria dos indivíduos LTNP; esses aspectos devem ser levados em conta na perspectiva do desenvolvimento de uma vacina candidata contra o HIV-1.

T lymphocytes (T-L) have a paramount role in the control of HIV-1 infection. The responses mediated by these cells against HLA class I epitopes may be associated to the natural protection in long-term non-progressors (LTNP). The literature suggests that some HLA alleles relate to the protection against the immune dysfunction. The aim of this research is to study the recognition of HIV-1 Gag, Nef and RT epitopes by T-L through an ELISPOT IFN-? assay in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of 24 LTNP selected from French ALT study group. We evaluated the frequency of anti-HIV-1 responses and identified HLA class I epitopes. All individuals presented specific responses to the pools of peptides tested with a median of 5 (2-12). Gag-p24 and Nef were the most frequently recognized proteins. The magnitude of the responses varied from 160 to 12307 SFC/106 PBMC (median=2025). We observed the recognition of 22 epitopes already described in HIV-1 Gag-p17, Gag-p24 and Nef, restricted to HLA class I molecules reported as protective. We have also observed four new epitopes not already described in the literature. Our results suggest that: HIV-1 responses by T-L are present in LTNP; the presence of HLA class I molecules associated with protection in the majority of LTNP are related to the recognition of MHC restricted HIV-1 epitopes; these aspects must be taken into account in the development of a candidate vaccine against HIV-1.

Considerações sobre a alergia ao látex / Latex allergy considerations

A alergia ao látex mediada pela IgE é significativa em todo o mundo. ela é ainda menos prevalente, por razões desconhecidas, em regiões trocipais. No Brasil não existe até o presente estudos epidemiológicos definitivos. A fator de alongamento da borracha (Hev b 1) de 14,6kD é o principal epítopo desta alergia, sendo produzido na manufatura atual do látex proveniente da Hevea brasiliensis. Os fatores de risco para a alergia do tipo I ao látex (urticária de contato, angioedema, asma, rinite, conjuntivite e anafilaxia) são: atopia, dermatite de contato nas mãos, contato profissional freqüente (ambientes médicos, odontológicos, cirúrgicos, radiológicos e da indústria de produção), pacientes com spina bifida e portadores de malformações urogenitais, que requerem cateterismos vesicais e cirurgias freqüentes. Há reações de alergenicidade cruzada com frutas tropicais (kiwi, banana, abacate, maracujá, manga, pêssego, mamão, entre outras) e também nozes e crustáceos. Progressivamente outros aliementos também estão sendo "incriminados", e suas antigenicidades cruzadas com proteínas do látex estão em fase de estudos. O uso freqüente do látex na área da Saúde e a necessidade da prevenção de doenças infecto-contagiosas como a Aids, torna o problema da alergia uma preocupação internacional da maior relevância. Há materiais alternativos de poliuretano e de vinil adequados para a utilização na população alérgica ao látex. Evitar o uso do látex em procedimentos médicos e cirúrgicos pode ser o melhor caminho na busca da prevenção de tal sensibilização.

IgE mediated allergic reactions are worldwide present. They are less frequent in tropical regions for unknown reasons. Latex is extracted from Hevea braliliensis and the main epitope is Hev b 1 (14.6kD rubber elongation factor). Risk factors for latex allergy (contact urticaria, angioedema, asthma, rhinitis, conjunctivitis and anaphylaxis) are: atopy, hand contact dermatitis, professional exposure, and patients with spina bifida and congenital urogenital malformations. There is cross-reactivity with tropical fruits (kiwi, bananas, abacate, "fruit de la passion", mangoes, peaches, papaya), and also to other foods like chestnuts and shellfish. The modern widespread use of latex in Medicine requires special attention to the potentialdevelopment of latex sensitization. Latex-free environment and alternative materials (polyurethane and vynil) should be considered.